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QIIME2 2025.10: インターフェイスやプラグインの気になる更新があるQIIME2

2025/11/17に公開

はじめに

QIIME2 2026.1でQIIME2 viewなどのインターフェイスが一部更新されるようです。それに先立ち、2025.10で試験的にプラグインやAPIが公開されています。

qzvを1つにまとめることができるmake_reportとUIが更新されるbarplot2を含めて、下記論文のデータを使いながら確認してきます。

生理学的条件下でのヒト腸内環境のプロファイリング

Figure 1: Devices enable longitudinal sampling of the human intestine

QIIME2 2025.10の取得

まず、実行環境を用意します。singularityコンテナ化して使用します。

定義ファイルはこちらにアップロードしました。qiime2-2025.10.defとしてrecipeフォルダに配置していただき、下記コマンドでコンテナファイルであるqiime2-amplicon-2025.10.sifが生成可能です。

mkdir container
singularity build --fakeroot container/qiime2-amplicon-2025.10.sif recipe/qiime2-2025.10.def

確認

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime --help

singularityの導入については、公式サイトや以下の記事をご参考下さい。

データの取得

こちらのデータをSraRunTable.txtとしてmetadataフォルダに保存します。

配列データの取得

# Set variable
SIF="container/qiime2-amplicon-2025.10.sif"
SRA_DIR="00sra"
FQ_DIR="00Fastq"
SRA_TABLE="metadata/SraRunTable.txt"

# Create folder
mkdir -p $SRA_DIR $FQ_DIR

# Donwload sra file
awk -F',' 'NR > 1 {print $1}' "$SRA_TABLE" \
  | xargs -P 4 -I{} \
    singularity exec "$SIF" aria2c \
      -x 16 \
      -c \
      --dir="$SRA_DIR" \
      "https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/{}/{}"

# .sra -> fastq
awk -F',' 'NR > 1 {print $1}' "$SRA_TABLE" \
  | xargs -P 16 -I{} \
    singularity exec "$SIF" sh -c "
      parallel-fastq-dump \
        --sra-id $SRA_DIR/{} \
        --threads 4 \
        --outdir $FQ_DIR \
        --split-files &&
      pigz -p 8 $FQ_DIR/{}*fastq
    "

これでfastq.gzファイルが生成できました。

Manifestファイルの作成

seqfuのmetadataオプションでManifestファイルを作成します。

mkdir -p metadata

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif seqfu metadata \
--format manifest  \
-1 '_1' -2 '_2' \
--threads 32 \
00Fastq > metadata/Manifest.tsv

サンプルメタデータの取得

こちらのメタデータをmetadata/metadata.tsvとして保存して、qiime2の可視化ファイルqzv形式に変換します。

qiime metadata tabulate

mkdir -p results/qzv

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime metadata tabulate \
  --m-input-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/00_metadata.qzv

可視化用ファイル*qzvファイルは、qiime2 viewで内容を確認することが出来ます。

上記ではtsv→qzvに変換しましたが、検定結果を含む図などもqzvファイルとして生成することが可能です。また、qzv から htmlやpdfなどの別形式ファイルとして取得できる場合もあります。

データのインポート

seqfuにて作成したmetadataを使ってqiime2で扱えるqza形式にfastqファイルを変換します。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools import \
--type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
--input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2 \
--input-path metadata/Manifest.tsv \
--output-path results/qza/01_demux.qza

シーケンス情報の要約

qza形式に変換されたDemultiplexされたシーケンスデータを取得したので内容を確認してみます。

サンプルごとに取得された配列数や、Readクオリティ分布も把握できます。

MiSeqでのシーケンスデータ

qzvとして出力

qiime demux summarize

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime demux summarize \
  --i-data results/qza/01_demux.qza \
  --o-visualization results/qzv/01_demux.qzv

htmlとして出力

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
--input-path results/qzv/01_demux.qzv \
--output-path results/01_demux

results/01_demuxフォルダにindex.htmlがあり、ブラウザで開くと先のような図を確認することが出来ます。

DADA2によるデノイジング

qiime dada2 denoise-paired

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs results/qza/01_demux.qza \
  --p-trim-left-f 0 \
  --p-trim-left-r 0 \
  --p-trunc-len-f 250 \
  --p-trunc-len-r 180 \
  --p-n-threads 32 \
  --o-representative-sequences results/qza/02_asv-seqs.qza \
  --o-table results/qza/02_asv-table.qza \
  --o-denoising-stats results/qza/02_stats.qza \
  --o-base-transition-stats results/qza/02_base-transition-stats.qza

02_stats.qzvをhtmlファイルとして出力

# qza -> qzv
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime metadata tabulate \
  --m-input-file results/qza/02_stats.qza \
  --o-visualization results/qzv/02_stats.qzv

# qzv-> html
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
  --input-path results/qzv/02_stats.qzv \
  --output-path results/02_stats

results/02_stats/index.htmlでブラウザで確認可能。

DADA2の結果の可視化

feature-table summarize系のコマンドは、各サンプルとFeatureに関連する配列数とヒストグラムや要約統計量に関する情報を得ることが出来ます。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table summarize-plus \
  --i-table results/qza/02_asv-table.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-summary results/qzv/02_asv-table.qzv \
  --o-sample-frequencies results/qza/03_sample-frequencies.qza \
  --o-feature-frequencies results/qza/03_asv-frequencies.qza

また、feature-table tabulate-seqsコマンドを使うことで、Feature IDと配列をマッピングし、各配列をNCBI ntデータベースに対して簡単にBLASTするための情報をリンク可能です。

配列をクリックするとBlastnの検索ウィンドウに移動できる

qiime feature-table tabulate-seqs

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data results/qza/02_asv-seqs.qza \
  --m-metadata-file results/qza/03_asv-frequencies.qza \
  --o-visualization results/qzv/03_asv-seqs.qzv

base-transition-statsの可視化処理も記載しておきます。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
--input-path results/qza/02_base-transition-stats.qza \
--output-path results/02_base-transition-stats

base-transition-statsの結果を可視化するスクリプトと実行環境コンテナを作成しました。コンテナの定義ファイルはこちらのものを使用します。ファイルをコピーかダウンロードして、containerフォルダにビルドしたら使用可能です。

./container/dada2_plot_errorstats.sif \
python scripts/plot_errorstats.py \
results/02_base-transition-stats/Errorstats.tsv \
-o results/errorstats.html

DADA2の図そのままではありませんが、ある程度模倣出来ているかなと思います。altairで生成しているのでhtml形式でインタラクティブな図となっています。

Featureのフィルタリング

テーブルデータを確認すると単一のサンプルでのみ検出されている配列が多数あります。これらのシーケンスをフィルタリングして、処理対象のシーケンス数を減らしてみます。また低頻度リードのサンプルも削除します。

処理として、1. Featureテーブルをフィルタリングし、2. 次に新しいFeatureテーブルを使用して新しいテーブルに含まれる配列をフィルタリングします。

テーブルフィルタリング

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table filter-features \
  --i-table results/qza/02_asv-table.qza \
  --p-min-samples 2 \
  --p-min-frequency 2500 \
  --o-filtered-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza

新しいFeatureテーブルを使用して新しいテーブルに含まれる配列をフィルタリング

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table filter-seqs \
  --i-data results/qza/02_asv-seqs.qza \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --o-filtered-data results/qza/04_asv-seqs-ms2-mf2500.qza

ついでに新しいテーブルの要約

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table summarize-plus \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-summary results/qzv/04_asv-table-ms2-mf2500.qzv \
  --o-sample-frequencies results/qza/04_sample-frequencies-ms2-mf2500.qza \
  --o-feature-frequencies results/qza/04_asv-frequencies-ms2-mf2500.qza

系統分類

取得したASV配列に対して系統分類情報を付与します。データベース(分類器)は一般的に用いられているSilva 138を使用します。

また、他にもGTDBやGreengenes2が利用可能です。過去に今回と似たようなことを実施しているので良かったら参考にして下さい。

まず、事前作成済の各分類器ファイルをダウンロードします。

mkdir -p ref
wget -O 'ref/silva-138-99-nb-classifier.qza' \
  'https://data.qiime2.org/classifiers/sklearn-1.4.2/silva/silva-138-99-nb-classifier.qza'

取得したデータベース(分類器)を用いて配列に対して系統情報を付与します。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier ref/silva-138-99-nb-classifier.qza \
  --i-reads results/qza/04_asv-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --o-classification results/qza/05_taxonomy.qza \
  --p-n-jobs 32

次に分類情報を配列データに対しても付与します。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data results/qza/04_asv-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --i-taxonomy results/qza/05_taxonomy.qza \
  --m-metadata-file results/qza/04_asv-frequencies-ms2-mf2500.qza \
  --o-visualization results/qzv/05_asv-seqs-ms2-mf2500.qzv

05_asv-seqs-ms2-mf2500.qzvの内容

Feature IDと配列情報に加えて、系統情報が追加されました。

05_asv-seqs-ms2-mf2500.qzvをhtmlファイルとして出力

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
--input-path results/qzv/05_asv-seqs-ms2-mf2500.qzv \
--output-path results/05_asv-seqs-ms2-mf2500

多様性解析

QIIME2では多様性解析はスタートとして一般的に系統樹を作成することが多く、リファレンスベースとリファレンスを用いないDe novoベースのアプローチがあります。

リファレンスベースのアプローチは、QIIME2のデフォルトだと16s rRNA遺伝子に特化しています。実行時間が長いことに注意が必要です。

De novoベースのアプローチは、16s以外にも系統学的に有益なマーカー遺伝子であれば、どのような遺伝子領域のデータにも適用できます。

kmerベースの多様性解析

例外的にkmerベースのアプローチ(q2-boots/q2-kmerizer)で多様性解析を実施する例もあります。

q2-bootsの論文

q2-kmerizerの論文

上記プラグインはQIIME2 2025.10で追加されました。本章では、kmerベースのアプローチで多様性解析を進めてみます。

qiime boots kmer-diversity

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime boots kmer-diversity \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --i-sequences results/qza/04_asv-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --p-sampling-depth 20 \
  --p-n 10 \
  --p-kmer-size 5 \
  --p-replacement \
  --p-alpha-average-method median \
  --p-beta-average-method medoid \
  --o-resampled-tables results/06_kmer-diversity/bootstrap-tables/ \
  --o-kmer-tables results/06_kmer-diversity/kmer-tables/ \
  --o-alpha-diversities results/06_kmer-diversity/bootstrap-alpha-diversities/ \
  --o-distance-matrices results/06_kmer-diversity/bootstrap-distance-matrices/ \
  --o-pcoas results/06_kmer-diversity/bootstrap-pcoas/ \
  --o-scatter-plot results/qzv/06_scatter-plot.qzv

系統樹ベースの多様性解析

上記kmerベースの多様性解析とは別に一般的な系統関係を加味した多様性解析を実施します。

mafftによるMultiple sequence alignmentを実施後に系統樹を生成します。

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
  --i-sequences results/qza/04_asv-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --o-alignment results/qza/07_aligned-asv-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --o-masked-alignment results/qza/07_masked-aligned-rep-seqs-ms2-mf2500.qza \
  --o-tree results/qza/07_unrooted-tree-ms2-mf2500.qza \
  --o-rooted-tree results/qza/07_rooted-tree-ms2-mf2500.qza \
  --p-n-threads 'auto'

α-/β-多様性解析

α多様度指数を対象にした解析を下記で実施します。

多様度の算出

qiime diversity core-metrics-phylogenetic

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
  --i-phylogeny results/qza/07_rooted-tree-ms2-mf2500.qza \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --p-sampling-depth 10000 \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --output-dir results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic \
  --p-n-jobs-or-threads 'auto'

α多様度の中央値の差の検定法として、ノンパラメトリック検定であるKruskal-wallis検定が実行できます。

Faith-pd

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/faith_pd_vector.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/07_faith-pd.qzv

evenness

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/evenness_vector.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/07_evenness.qzv

次に、グループ間の多変量な差異を評価するPERMANOVAを実施します。

comp_set=(host_sex sample_type)

Unweighted unifrac

for comp in ${comp_set[@]}; do
  ./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity beta-group-significance \
    --i-distance-matrix results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza \
    --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
    --m-metadata-column ${comp} \
    --p-pairwise \
    --p-method 'permanova' \
    --o-visualization results/qzv/08_unweighted-unifrac-${comp}.qzv \
    --verbose
done

Weighted unifrac

for comp in ${comp_set[@]}; do
  ./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity beta-group-significance \
    --i-distance-matrix results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/weighted_unifrac_distance_matrix.qza \
    --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
    --m-metadata-column ${comp} \
    --p-pairwise \
    --p-method 'permanova' \
    --o-visualization results/qzv/08_weighted-unifrac-${comp}.qzv \
    --verbose
done

Jaccard distance

for comp in ${comp_set[@]}; do
  ./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity beta-group-significance \
    --i-distance-matrix results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/jaccard_distance_matrix.qza \
    --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
    --m-metadata-column ${comp} \
    --p-pairwise \
    --p-method 'permanova' \
    --o-visualization results/qzv/08_jaccard-${comp}.qzv \
    --verbose
done

bray curtis

for comp in ${comp_set[@]}; do
  ./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity beta-group-significance \
    --i-distance-matrix results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/bray_curtis_distance_matrix.qza \
    --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
    --m-metadata-column ${comp} \
    --p-pairwise \
    --p-method 'permanova' \
    --o-visualization results/qzv/08_bray_curtis-${comp}.qzv \
    --verbose
done

PCoA

主座標分析 (PCoA) を実行します。

# Unweighted unifrac
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime emperor plot \
  --i-pcoa results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/unweighted_unifrac_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/08_unweighted-unifrac-pcoa.qzv

# Weighted unifrac
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime emperor plot \
  --i-pcoa results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/weighted_unifrac_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/08_weighted-unifrac-pcoa.qzv

# Jaccard
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime emperor plot \
  --i-pcoa results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/jaccard_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/08_jaccard-pcoa.qzv

# Bray curtis
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime emperor plot \
  --i-pcoa results/07_diversity-core-metrics-phylogenetic/bray_curtis_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/08_bray-curtis-pcoa.qzv

Alpha-rarefaction curve

α多様性のRead数における累積曲線(Rarefaction curve)を描画します。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime diversity alpha-rarefaction \
 --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
 --i-phylogeny results/qza/07_rooted-tree-ms2-mf2500.qza \
 --p-max-depth 50000 \
 --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
 --o-visualization results/qzv/09_alpha-rarefaction.qzv

alpha-rarefaction.qzvをhtmlファイルとして出力

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
--input-path results/qzv/09_alpha-rarefaction.qzv \
--output-path results/09_alpha-rarefaction

棒グラフによる可視化

QIIME2 2026.1の出力として変化があるAPIとしてBarplotが挙げられます。今はbarplot2として現在提供されています。

分類群とサンプルのフィルタリング、一部の分類群の下位レベルへの拡張など、長い間要望の多かった機能が追加され、ています。

並べて比較してみました。

左がbarplot2で右がbarplot

# barplot
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime taxa barplot \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --i-taxonomy results/qza/05_taxonomy.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/10_taxa-bar-plots.qzv

# barplot2
./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime taxa barplot2 \
  --i-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --i-taxonomy results/qza/05_taxonomy.qza \
  --m-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --o-visualization results/qzv/10_taxa-bar-plots2.qzv

10_taxa-bar-plots.qzvをhtmlファイルとして出力

qiime tools export

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime tools export \
--input-path results/qzv/10_taxa-bar-plots.qzv \
--output-path results/10_taxa-bar-plots

系統樹による可視化

少し古いですが、emprressと呼ばれるパッケージがあります。

qiime2で唯一系統樹作成をサポートしているパッケージなので簡単な出力だけ試してみます。

./container/qiime2-amplicon-2025.10.sif qiime empress community-plot \
  --i-tree results/qza/07_rooted-tree-ms2-mf2500.qza \
  --i-feature-table results/qza/04_asv-table-ms2-mf2500.qza \
  --m-sample-metadata-file metadata/metadata.tsv \
  --m-feature-metadata-file results/qza/05_taxonomy.qza \
  --o-visualization results/qzv/11_empress-tree.qzv

11_empress-tree.qzvをhtmlファイルとして出力